microRNA芯片實驗
microRNA芯片實驗
劍鈍生物microRNA芯片實驗流程
1. 樣品RNA抽提
a. 實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正存的組織樣品，使用 BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。
b. 實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（樣品為貼壁細胞，每10cm2培養皿TRIzol使用量為1ml），裂解后抽提RNA。
2. RNA 質量檢測
a. 使用Nanodrop測定RNA 在分光光度計260nm 、280nm和230nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。
b. 用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 純度及完整性。
c. 提供RNA QC報告。
注意：用于芯片檢測的RNA樣品，是高質量的，完整的，沒有RNase污染（降解的樣品不能用于標記和芯片檢測），沒有基因組污染。
3. 制備熒光標記探針
采用miRCURY? Array Power 標記試劑盒，用標記酶將Hy3?或Hy5?熒光基團標記miRNA, 可以得到用于與芯片雜交的熒光探針。
4. 芯片雜交
在標準條件下使用MAUI雜交儀將標記好的探針和miRCURY?芯片雜交。
5. 圖像采集和數據分析
使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，并將實驗結果轉換成數字型數據保存，使用配套軟件對原始數據進行分析運算。
6. 提供實驗報告—— 包括詳細的實驗方法和芯片實驗數據及圖表
a. 芯片掃描圖
b. 操作說明（含RNA質檢報告）
c. 芯片數據
數據匯總表格（EXCEL格式，包含探針位置，探針名稱，原始信號值，修正信號值，標準化信號值，樣品間microRNA表達量的比值）
差異表達microRNA的數據表格（EXCEL格式，包含表達上調2倍的microRNA和表達下調2倍的microRNA）
d. 進一步數據分析
Scatter Plot（主要針對單色重復實驗數據進行相關性R值計算）
分層聚類（進行多個樣品實驗時，按基因表達相似程度進行聚類，從而將多個樣品進行歸類）
若進行重復實驗（≥3）則計算CV值、p值，并做Volcano Plot
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