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          引物設計與合成實驗.

          產品介紹

                               引物設計與合成實驗.

          一、 引物設計與合成實驗.原則

          聚合梅鏈式反應(polymerase chain reaction)即PCR技術,是一種在體外快速擴增特定基因或DNA 序列的方法,故又稱基因的體外擴增法。PCR技術已成為分子生物學研究中使用多,廣泛的手段之一,而引物設計是PCR技術中至關重要的一環,使用不合適的PCR引物容易導致實驗失?。罕憩F為擴增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶),不出帶或出帶很弱,等等?,F在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行,可以直接提交模板序列到特定網頁,得到設計好的引物,也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。引物設計原則如下:

          1、引物應在序列的保守區域設計并具有特異性。引物序列應位于基因組DNA的高度保守區,且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結合,提高反應的特異性;

          2、引物的長度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp,但不應大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進行反應;

          3、引物不應形成二級結構。引物二聚體及發夾結構的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導致產生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行;

          4、引物序列的GC含量一般為40-60%。過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大;

          5、引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件佳。Tm值的計算有多種方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T);

          6、引物5'端序列對PCR影響不太大,因此常用來引進修飾位點或標記物??筛鶕乱徊綄嶒炛幸迦隤CR產物的載體的相應序列而確定。

          7、引物3'端不可修飾。引物3'端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率,末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應當避免在引物的3'端使用堿基A。

          8、引物序列自身或者引物之間不能在出現3個以上的連續堿基,如GGG或CCC,也會使錯誤引發機率增加;

          9、G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3'端 G值較低(值不超過9),而5'端和中間 G值相對較高的引物。引物的3'端的 G值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應;

          值得一提的是,各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導致找不到各種指標都十分合適的引物;在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定,引物設計的選擇自由度較低,在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。

           服務特點:

          1. 提供引物設計的參考序列,設計原理和分析報告,讓您對您的引物或探針的性能和特點有一個的了解,便于您對實驗結果的認識和分析。

          2. 可提供擴增前的與處理及擴增后服務:包括,核酸提取,pcr,核酸純化,序列分析,數據統計等服務。             

          3. 一次的服務,全程的保障。

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